Blood：肠道微生物失调影响DLBCL免疫化疗的疗效及安全性

1、初治、新诊断的弥漫性大B细胞淋巴瘤患者存在肠道微生物微生态失调。

2、肠杆菌科细菌的丰度与治疗结局和RCHOP化疗后的发热性中性粒细胞减少症相关

作者收集了该前瞻性队列研究 (NCT03117036) 中登记的初治、新诊断DLBCL 患者的粪便样本。入选标准如下：1）计划接受免疫化疗的新诊断（初治）DLBCL患者， 2）年龄≥20岁。排除标准如下：1）存在炎症性肠病，2）参与研究前1个月内有急性炎症或感染性疾病史，3）参与研究前1个月内使用抗生素、类固醇或免疫抑制剂，4）既往进行过累及胃肠道的手术， 5）使用人工营养。患者接受 RCHOP 化疗6个周期，每个周期预防性给予聚乙二醇化G-CSF。在 RCHOP 化疗期间记录发热性中性粒细胞减少症的发生。

大多数患者在家中使用采样试剂盒采集粪便样本。在 RCHOP 化疗开始前使用含有缓冲液的粪便采样试剂盒在室温下储存粪便样本，以无菌方式获得新鲜粪便，将样本运送至实验室提取 DNA 进行 16S rRNA 分析。

首先使用189例患者中158例获得的粪便样本进行 16S rRNA 基因测序，将其基于 16S rRNA 基因测序结果的肠道菌群与年龄、性别匹配的健康对照者 (n=158) 进行比较。对于功能和种属水平的分类分析，在158例粪便样本可用于额外鸟枪法测序的患者中，对106例患者的样本进行额外的 WGS 测序（图1A）。

分析的目的包括：确定与健康对照组相比，DLBCL患者存在肠道微生态失调；确定诊断时从 16S rRNA 和鸟枪法测序获得的微生物组数据是否与 RCHOP 化疗期间发热性中性粒细胞减少的发生相关；通过比较 RCHOP 化疗后复发或进展的患者与缓解维持的患者，确定肠道菌群的特征是否与治疗结局相关（图1A）。

患者特征和结局

在189例患者中，男性 (n=119，63%) 多于女性 (n=70，37%)，91例患者年龄大于60岁（48%，表1）。大多数患者 (n=144，76%) 的 ECOG 体能状态为0。血清 LDH 水平升高90例 (48%)，仅12例伴骨髓受累 (6%)。III/IV 期占患者的42%(n=80)。根据 IPI 评分，95例患者为IPI低危（评分0或1），19例患者为高危（表1）。

RCHOP 化疗总有效率为95%(180/189)，包括171例完全缓解患者；4例 RCHOP 无效，5例未进行疗效评估。RCHOP 化疗期间发生发热性中性粒细胞减少39例 (21%)。中位随访16.4个月，20例患者发生疾病复发（表1）。189例患者中有158例首先采用 16S rRNA 基因测序检查肠道菌群，对这158例患者中有106例样本可用于鸟枪法测序的患者进行 WGS 测序。其基线特征和 RCHOP 化疗后的治疗结局与总研究人群相似（表1）。

DLBCL患者与健康对照者肠道菌群的比较

16S rRNA 基因测序显示，DLBCL患者的α多样性低于健康对照组，β多样性也存在显著差异（P<0.001，图1B，C）。在门分类水平肠道微生物组成的分类学比较中，DLBCL患者的变形菌门显著多于健康对照组（图1D，E）。在族水平上，DLBCL患者的肠杆菌科和 Suterellaceae 丰度更高，而健康对照的毛螺菌科、普雷沃氏菌科和 Coriobacteriaceae 丰度更高（图1F，G）。

在106例患者中作为功能性和种属水平分类分析进行的 WGS 测序显示，使用 16S rRNA 和 WGS 测序的分析之间肠道菌群无显著差异（图2A，B）。利用 WGS 测序数据，LEfSe分析在菌种水平上鉴定了兼性厌氧菌种的丰度，尤其是肠杆菌科的丰度，包括大肠埃希菌、弗劳地枸橼酸杆菌和屎肠杆菌（图2C）。群落功能分析显示这些厌氧菌种与机会性发病机制相关，如1型菌毛、生物膜形成、宿主 AMP 耐药和抗生素耐药基因（图2D）。相比之下，普雷沃菌、Phocaeicola、Anaerostipes、双歧杆菌、粪脂杆菌属和 Agathobacter（属于产短链脂肪酸 (SCFA) 共生菌群），在健康对照组中含量丰富（图2C）。

通过机器学习分析，以验证该微生物组数据库用于区分 DLBCL 患者和健康人群的可行性。通过 DLBCL 患者的种属水平分类和基因水平功能谱，使用随机森林方法的训练模型在分类谱（图2E）和功能谱（图2F）方面显示出较高的预测准确性。

微生物微生态失调与发热性中性粒细胞减少症

使用 WGS 测序分析样本的106例患者中，23例在 RCHOP 化疗期间发生发热性中性粒细胞减少（表1）；这23例患者中的16例减少了剂量。出现发热性中性粒细胞减少的患者在门水平的变形菌门水平高于未出现的患者，但差异无统计学意义（图3A）。但在族水平的比较显示，发热性中性粒细胞减少患者中肠杆菌科细菌的丰度较高，而无发热性中性粒细胞减少患者中普雷沃菌科和 Oscillospiraceae 的丰度较高（图3B，C）。这些结果表明，发生和未发生发热性中性粒细胞减少症的 DLBCL 患者之间肠杆菌科的丰度有差异。

尽管根据发热性中性粒细胞减少的存在与否，α多样性没有显著差异（P=0.211，图3D），但对于两种比较，有和无发热性中性粒细胞减少的患者以及健康对照者之间的β多样性显著不同（P<0.001，图3E）。这一发现表明，在 RCHOP 化疗期间发生发热性中性粒细胞减少症的 DLBCL 患者与健康对照组以及无发热性中性粒细胞减少症的 DLBCL 患者相比，其微生物组谱中肠杆菌科的丰度更高。线性回归分析显示，β多样性差异的主要驱动力是肠杆菌科的丰度（图3F）。在种属水平上，LEfSe分析确定了发热性中性粒细胞减少患者中大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌的丰度（图3G）。这些菌种的功能分析也证明了与发热性中性粒细胞减少患者的1型菌毛、菌毛和抗生素耐药性的关系。

微生物微生态失调与治疗结局

通过典型对应分析探索细菌种类与反映肿瘤负荷的临床和实验室特征之间的关系。在所有细菌家族中，只有肠杆菌科细菌与高肿瘤负荷的特征显著相关，如 III 期或 IV 期疾病（图4A）。综合预后指标（如 IPI 和NCCN-IPI）也与肠杆菌科丰度显著相关，而年龄和 CNS-IPI 不相关。在线性回归中，分期与肠杆菌科细菌的丰度显著相关（图4A）。基于分期的β多样性比较也显示 I 期或 II 期与 III 期或 IV 期之间肠道菌群存在显著差异（P<0.001，图4B）。

肠杆菌科细菌的丰度与患者的分期（P=0.035，图4C）和血清 LDH 水平（P=0.002，图4D）均相关。III 期或 IV 期患者发生发热性中性粒细胞减少的频率高于 I 期或 II 期患者（P<0.001，图4E）。在基于分期的亚组分析中，肠杆菌科细菌的丰度在 III 期或 IV 期患者中显著富集（P=0.004，图4E）。尽管微生物组微生态失调与肿瘤负荷相关，但基于复发或进展的α多样性无显著差异（P=0.467，图4G），而复发或进展患者与维持缓解患者之间在β多样性（P=0.043，图4F）和肠杆菌科细菌的相对丰度（P=0.038，图4H）存在显著差异。

在生存分析中，在 RCHOP 化疗期间发生发热性中性粒细胞减少的患者PFS 显著差于未发生发热性中性粒细胞减少的患者（P=0.050，图5A）。将106例患者的样本通过 WGS 测序分析为肠杆菌科的低（0-50百分位数）和高（51-100百分位数）丰度后，肠杆菌科高丰度患者的 PFS 显著差于低丰度患者（P=0.007，图5B）。III 期或 IV 期疾病伴高丰度肠杆菌科细菌患者的 PFS 最差（P=0.001，图5C），但III期或 IV 期伴肠杆菌科细菌低丰度患者与 I 期或 II 期患者的 PFS 无差异。低丰度和高丰度肠杆菌科细菌患者的基线特征无显著差异。

生存期的多变量分析显示，肠杆菌科细菌的丰度与 PFS 较差独立相关（表2）。

因为治疗前炎性细胞因子可能与结局相关，作者进一步评估了肠道菌群和治疗前细胞因子水平之间的相关性。在粪便采样时获得的样本中，血清IL-6 (P=0.035) 和IFN-γ (P=0.045) 水平与肠杆菌科丰度显著相关（图5D，E）。肠杆菌科细菌在有氧呼吸中具有高代谢效率，其丰度可能威胁其他生物的生存，因此增加其他菌株的丰度可能有助于肠道脱氧环境和降低肠杆菌科细菌丰度（图5G）

本研究首次将 WGS 用于 DLBCL 初治患者微生物组分析的全面微生物组研究。通过对 DLBCL 患者和健康对照者的微生物组进行比较，发现 DLBCL 患者存在肠道微生态失调，肠杆菌科细菌丰度更高。发生治疗相关发热性中性粒细胞减少的晚期患者的肠杆菌科细菌丰度更高，肠杆菌科细菌富集的患者结局较差。考虑到这些结果，建议增加共生细菌的群落以恢复健康的肠道微生物群落，以降低肠杆菌科的丰度。但还需要更广泛的临床研究来验证这些发现，并明确肠道菌群在发热性中性粒细胞减少发生中的可能作用及其对治疗结局的影响，以改善接受 RCHOP 化疗的 DLBCL 患者的疗效。

杂志同期发表Camille Bigenwald和Laurence Zitvogel教授的点评认为，本研究是关于新诊断 DLBCL 患者粪便分类组成对预后影响的最大分析，突出了肠道肠杆菌科细菌相对过量对治疗毒性和失败的负面影响。该研究提示肠道肠杆菌科细菌、全身炎症和免疫抑制、发热性中性粒细胞减少和复发之间的恶性循环。因此，恢复“肠道微生态”和肠道屏障适合度可能是完善 RCHOP 疗效的强制性先决条件。因此在 DLBCL 一线患者中，应考虑增加短链脂肪酸产生菌（普氏菌、毛螺旋菌科和粪脂杆菌属）的相对优势（使用高纤维饮食、特定益生元、益生菌或复杂的微生物生态系统）。