IVD前沿丨改进Tm mapping法可适配各种仪器快速鉴别致病微生物

脓毒症的明确诊断需要正确识别致病微生物。尽早识别病原微生物对于选择合适的抗菌药物治疗和在感染患者中获得有利的结果至关重要。之前此文章作者曾报道了一种新的快速，简单和经济有效的方法，称为熔融温度(Tm)映射法，用于在全血采集后3小时内识别广泛的致病菌。然而，Tm鉴定需要在同一试验中PCR管间的测量误差不超过0.1°C，因此只能使用最佳的分析仪器，如QIAGEN或Roche Applied Science的仪器，这是此方法推广的主要障碍。

近日，杂志Scientific reports上发表了一篇题为“Melting temperature mapping method using imperfect-match linear long probes”的文章。为了解决上述问题，作者开发了一种不完全匹配线性长探针的改进Tm映射方法。利用长探针，Tm映射方法可以产生更大的Tm值变化范围，从而几乎所有市售的分析仪器都可以用于Tm映射方法。

图片来源：Scientific reports

主要内容

不完全匹配线性长探针(IMLL Q探针)Tm映射方法的工作流程

使用IMLL Q探针识别未知病原体的Tm映射方法的工作流程。包括四个主要步骤。首先，从临床样本中提取细菌DNA作为PCR的模板。第二步利用真核细胞制造的耐热DNA聚合酶，使用5个细菌通用引物组进行巢式PCR (图b)，并获得五个(或更少)PCR扩增子。第三步，将1区和3区PCR扩增子分成两部分，然后将共7个PCR扩增子与7种IMLL q探针混合(图a-c)。通过分析7个IMLL q探针获得7个Tm值。第四步在两个维度上制图七个Tm值，称为Tm映射形状，并与数据库中的形状进行比较，可以快速鉴定分离的细菌。该方法在全血采集后3小时内鉴定临床样本中的优势细菌(通常是致病菌)，且可以与几乎所有市售的实时PCR仪器一起使用。

IMLL Q探针Tm映射方法的工作流程。

图片来源：Scientific reports

设计IMLL Q探针的策略

作者设计IMLL Q探针时，有四点需要考虑。首先，使不同菌种的Tm值有更大的变化范围。其次，设计足够长的探针(大约40 mer)来结合几乎所有种类的细菌，即使有多处错配。第三，设计不具有二级结构而是具有线性结构的长探针，以防止自猝灭。最后，设计探针以获得各种细菌种类的Tm值，并可用来鉴定细菌种类。结果显示，使用IMLL Q探针，71种细菌的Tm值范围超过20°C。

利用IMLL Q探针构建Tm映射数据库

使用IMLL Q探针测量三次Tm值的平均值，作者构建了68个物种Tm图谱形状的初步数据库(下图)。单个Tm映射形状显示出独特的形状，反映了每种细菌的IMLL Q探针杂交中错配的数量和位置。鉴定软件程序将其搜索范围缩小到数据库中与IMLL Q-probe结合模式相同的细菌。

Tm映射数据库数种细菌Tm形状示意图。

图片来源：Scientific reports

利用IMLL Q探针评估Tm映射方法的精度

作者使用Rotor-Gene Q仪器鉴定细菌DNA。在68种细菌中，62种Tm映射结果与Sanger测序结果相匹配，但6种Tm定位结果无法缩小到单一细菌物种，比如不能区分粪肠球菌和屎肠球菌，也不能区分金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、人型葡萄球菌和路邓葡萄球菌。这是因为当IMLL Q-probes属于同一属时，它们的目标碱基序列的多样性是有限的。对于葡萄球菌属，作者做了一个短探针专门鉴定金黄色葡萄球菌，成功地将金黄色葡萄球菌与CNS区分开来，耗时10分钟。

在几乎所有市售的实时PCR仪器中，使用IMLL Q探针的Tm映射方法能够在物种水平上识别68种细菌中的至少60种；其余8个Tm的定位结果在属水平上是匹配的，但无法缩小到单个细菌物种。

临床样本的验证

利用18例脓毒症患者的全血样本，作者比较了使用IMLL Q探针和LightCycler 480仪器的Tm映射方法与传统培养方法的准确性。作为阴性对照，Tm映射法和常规培养法均未检出健康全血细菌。在18个Tm映射结果中，有13个与培养或测序结果相匹配，但对于粪肠球菌或葡萄球菌属，Tm结果无法缩小到单一细菌种。此外，在9号患者中，培养结果显示流感嗜血杆菌、产氧克雷伯菌和肺炎链球菌，而Tm映射和测序结果仅显示流感嗜血杆菌，这是因为Tm映射方法能够仅识别临床样品中的优势细菌。

临床样本的验证结果。图片来源：Scientific reports

总结与讨论

作者开发了一种不完全匹配线性长探针的改进Tm映射方法。利用长探针，Tm映射方法可以产生更大的Tm值变化范围，从而几乎所有市售的分析仪器都可以用于Tm映射方法。使用IMLL Q探针的Tm映射方法能够在全血采集后3小时内鉴定临床样品中的优势细菌。值得注意的是，与目前的Tm定位方法相比，几乎所有市售的实时PCR仪器都可以使用使用IMLL q探针的改进Tm鉴定方法。有些细菌种类不能缩小到单一种类，但它们至少可以缩小到属的水平。在这种情况下，可以使用定制的短探针来识别特定的细菌，这只需要10分钟即可完成。使用IMLL Q探针的Tm映射方法对于检测需要及时治疗的传染病(如败血症)特别有用，预计将有助于治疗严重感染患者。