中山三院Sci.Adv.：生物启发水凝胶促进脊髓损伤后特定神经再连接

一种由透明质酸-接枝-多巴胺（HADA）和设计肽HGF-(RADA)₄-DGDRGDS（HRR）组成的生物启发性水凝胶被中山三院戎利民/何留民提出，用于增强脊髓损伤（SCI）后的组织整合。HADA/HRR水凝胶操纵了PDGFRβ⁺细胞的渗透，形成平行模式，将密集的瘢痕转化为有序的纤维基质，引导轴突再生。进一步加入NT3和姜黄素促进了损伤边缘的轴突再生和内神经元的存活，这些内神经元作为中继站，以目标特异性的方式建立异质性轴突连接。在完全脊髓横断的大鼠中，运动、感觉和膀胱功能的显著改善得到了实现。HADA/HRR + NT3/Cur水凝胶促进了脊髓前部V2a神经元的积累，有助于恢复运动功能。同时，在犬的半切损伤中，通过神经元中继以目标特异性方式建立异质性神经连接，显著改善了运动功能。因此，生物材料可以激发对SCI修复有益的生物活动。该研究以题为“Integrating hydrogels manipulate ECM deposition after spinal cord injury for specific neural reconnections via neuronal relays”的论文发表在《Science Advances》上。

图1通过将多巴胺（DA）接枝到透明质酸（HA）上合成了HADA，并与设计师肽HRR结合形成了HADA/HRR水凝胶。这种水凝胶在紫外光下显示出DA的特征吸收峰，证明了DA的成功接枝。HADA/HRR水凝胶在注射后能够自主融合成一个整体，展现出良好的自愈合特性和注射性，能够在受到严重变形后迅速恢复其力学性能。此外，水凝胶与脊髓组织的粘附能力强，这归因于儿茶酚胺的组织粘合能力。因此，HADA/HRR水凝胶具有与宿主脊髓良好的生物力学适应性，能够通过可逆的动态醌/儿茶酚化学和非共价相互作用实现自愈合，适合作为医疗植入物，抵抗体内不可避免的机械力量。

图 1.创建具有增强脊髓组织整合的生物启发性水凝胶

【HADA/HRR基水凝胶在完全横断部位操纵ECM沉积】

图2讨论了HADA/HRR基水凝胶如何在脊髓损伤后操纵细胞外基质（ECM）的重塑过程。与对照组相比，HADA/HRR基水凝胶处理的损伤区域在2周后显示出明显的ECM排列，沿着脊髓轴形成短纤维。这种排列趋势通过Laminin（Ln）纤维与脊髓长轴之间的角度分布统计分析得到了证实。HADA/HRR基水凝胶显著降低了Ln密度，并且当水凝胶中加入NT3和Cur时，观察到更有序的ECM排列和更低的Ln、Fibronectin（Fn）和Collagen I（Col I）密度。此外，HADA/HRR基水凝胶处理后，观察到再生轴突与Ln纤维保持连续接触，并且许多再生轴突也与Fn和Col I纤维接触。因此，HADA/HRR基水凝胶通过操纵ECM的重塑，为损伤后的轴突再生提供了支持性基质，从而促进了轴突的再生和神经功能的恢复。

图 2.HADA/HRR基水凝胶在完全横断部位操纵ECM沉积

【SCI后炎症反应的调节】

研究表明，损伤引发的炎症反应在损伤后1周达到高峰，此时CD68+细胞（一种标记激活的免疫细胞）在损伤区域显著增加。然而，HADA/HRR基水凝胶，尤其是加载了NT3和Cur的版本，能够显著减少这些激活的免疫细胞的数量，并且促进它们表达CD206（与抗炎反应相关的标记），显示出水凝胶在调节急性炎症方面的卓越能力。此外，水凝胶的持续释放Cur（一种有效的抗氧化剂）有助于维持这种免疫调节效果。通过定量PCR分析，HADA/HRR基水凝胶显著抑制了促炎因子（如iNOS、IL-1β、TNF-α和IL-6）的mRNA表达，同时促进了抗炎因子（如ARG-1、IL-10和TGF-β）的mRNA表达。

图3.SCI后炎症反应的调节

【SCI后PDGFRβ+细胞操纵ECM沉积】

图4讨论了HADA/HRR基水凝胶如何通过操纵PDGFRβ⁺成纤维细胞的浸润模式来影响脊髓损伤后的ECM沉积。研究表明，PDGFRβ⁺成纤维细胞在损伤后形成的瘢痕中扮演了重要角色，它们在损伤边界区域与ECM成分Laminin (Ln)高度共定位，并在HADA/HRR基水凝胶处理下显示出类似的分布模式。这些细胞在水凝胶处理后，其增殖状态（通过Ki67表达标记）显著减少，表明HADA/HRR基水凝胶能够减少这些细胞对ECM沉积的贡献。此外，通过西方印迹分析发现，HADA/HRR基水凝胶对稳定形态的去酪氨酸微管蛋白（DetyrTub）的表达水平没有显著影响，但水凝胶处理改变了PDGFRβ+成纤维细胞的形态，从圆形变为伸长和双极形态。研究还发现，使用微管稳定剂EpoB处理能够抑制瘢痕形成，但在本研究中，EpoB处理却抑制了轴突再生。因此，HADA/HRR基水凝胶通过调节PDGFRβ+成纤维细胞的行为，对瘢痕形成过程进行了逆转，将其转化为支持轴突再生的基质，而不是通过结构性消除瘢痕来促进轴突生长。

图 4.SCI后PDGFRβ+细胞操纵ECM沉积

【整体展示损伤跨越处的神经中继】

经过HADA/HRR基水凝胶处理后，AAV标记的皮质脊髓束（CST）轴突在损伤部位远端的白质中重新生长，并在接近损伤边界处终止。特别是，当水凝胶中加载了NT3和Cur时，观察到更显著的局部脊髓轴突再生，导致CST到损伤的距离稳步减少。此外，水凝胶处理增强了损伤边界处宿主神经元的存活，表现为神经元密度的显著增加，这些神经元表现出成熟的形态，并与突触标记物共定位，表明突触网络的形成可能有助于信息的中继传递。通过电生理测试，发现运动诱发电位（MEP）的幅度显著增加，反应潜伏期减少，这表明形态学上的突触连接促进了损伤部位的信号传递，即使没有长距离的轴突生长。这些结果表明，HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶通过激活和整合宿主神经元，促进了损伤部位的神经再生和功能恢复。

图 5.整体展示损伤跨越处的神经中继

【损伤处8周时表型适当的目标突触的神经中继连接】

图6阐述了HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶如何促进损伤处特异性的神经中继连接的形成。5-羟色胺能轴突（5HT+）在HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶中再生，并在损伤的近端和远端边界处与CST轴突及局部神经元建立了突触连接，尤其是在水凝胶中加载了NT3和Cur时，这种再生和突触形成的数量显著增加。此外，这些5HT+轴突的再生与运动功能恢复强相关。研究还观察到，来自脑干的TH+轴突和CGRP+轴突在水凝胶中再生，并在边界处形成了突触连接，这些轴突参与了膀胱反射回路和疼痛传递。HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶显著改善了SCI后的膀胱功能和感觉功能，减少了膀胱异常，并提高了对热痛刺激的痛阈。

图 6. 损伤处8周时表型适当的目标突触的神经中继连接

【损伤处8周时的神经激活】

图7探讨了HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶如何促进损伤边界处的神经元激活，以及这些激活的神经元如何参与神经功能的恢复。经过HADA/HRR基水凝胶处理，尤其是在加载了NT3和Cur的条件下，损伤边界处的c-Fos阳性神经元（即被激活的神经元）数量显著增加。这些激活的神经元在解剖位置上的分布模式发生了变化，从损伤后的背侧/中间区域向腹侧区域转移，表明与运动功能相关的神经元被更多地激活。特别是，表达Vsx2的兴奋性运动神经元在腹侧脊髓损伤边界处得到了增强的激活，这与运动功能的恢复密切相关。此外，通过跨突触逆行示踪技术，证实了损伤边界处的神经元形成了跨越损伤部位的连接。因此，HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶通过激活损伤边界处的神经元，特别是运动神经元，促进了神经功能的恢复，并可能通过增强神经元间的连接来改善运动功能。

图 7. 损伤处8周时的神经激活

【SCI犬半切模型中的轴突再生和突触整合】

图8展示了HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶在犬类半切脊髓损伤模型中促进轴突再生和突触整合的效果。与对照组相比，HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶处理的犬类在18周后，损伤区域的对侧脊髓组织保持完整，表明水凝胶具有保护作用。NF200+轴突沿着Laminin (Ln)纤维延伸进入水凝胶移植物，并在损伤边界处形成突触连接。此外，5HT+、TH+和CGRP+轴突在水凝胶中再生，并与局部神经元建立了突触连接，这些神经元表达了兴奋性或抑制性神经递质标记物，表明形成了功能性的神经网络。电生理测试显示，HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶处理的犬类在运动功能上得到了显著改善，步态更加稳定和协调。

图 8. SCI犬半切模型中的轴突再生和突触整合

【小结】

该研究开发了一种由透明质酸接枝多巴胺（HADA）和设计肽HGF-(RADA)₄-DGDRGDS（HRR）组成的生物启发性水凝胶，用于脊髓损伤（SCI）后的组织整合。这种水凝胶通过操纵PDGFRβ⁺细胞的渗透模式，将密集的瘢痕转化为有序的纤维基质，引导轴突再生。此外，NT3和姜黄素的加入进一步促进了损伤边缘的轴突再生和内神经元的存活，这些内神经元作为中继站，以目标特异性的方式建立异质性轴突连接，显著改善了运动、感觉和膀胱功能。在犬类半切脊髓损伤模型中，这种HADA/HRR+NT3/Cur水凝胶促进了精确的神经中继连接和表型适当的突触形成，证明了其在SCI治疗中的转化潜力。研究结果表明，生物材料可以通过激发有益的生物活动来促进SCI修复，为中枢神经系统损伤和疾病的治疗提供了新的思路。

原文链接：

https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.ado9120