王孝深教授组稿｜赵阳：选择性剪切在头颈鳞癌中作用概述

编者按：头颈部鳞状细胞癌（Head and Neck Squamous Cell Carcinoma, HNSCC）是一种常见且恶性程度高的肿瘤，占全身恶性肿瘤的5%-10%，全球每年约有90万新发病例，平均发病率约为10-15/10万。由于早期症状隐匿，60%以上的HNSCC患者初诊时即为局部晚期，预后并不理想。尽管在筛查、诊断和多模式治疗方面取得了进步，2年内仍有50%-60%的患者局部复发 ，20%-30%的患者出现远处转移，50%的患者因该疾病死亡。因此迫切需要进一步研究揭示HNSCC发生发展的机制。

本期「专家组稿」由复旦大学附属眼耳鼻喉科医院王孝深教授担任执行主编，与复旦大学附属眼耳鼻喉科医院赵阳博士分享《选择性剪切在头颈鳞癌中作用概述》，为医者和患者提供更多参考。

选择性剪切（Alternative Splicing, AS）是基因后转录过程中的一种关键调控机制。是tRNA、rRNA，特别是mRNA加工与成熟的重要生物学过程，也是蛋白质分子多样性产生的关键机制之一。选择性剪切是指细胞选择性地对前体RNA（pre-mRNA）进行剪切并组合加工，形成不同的成熟mRNA，从而使一个基因产生若干有独特结构和功能的蛋白异构体的过程，它是真核生物控制基因表达的一种重要机制。

选择性剪接的主要方式包括外显子跳跃、外显子互斥、5′端位点的剪接、3′端位点的剪接、内含子保留。有大于70％的人类基因可发生选择性剪接产生多种异构体。它通过不同的剪接方式从一个基因中产生多种mRNA剪接异构体，进而翻译成功能多样的蛋白质。

HNSCC的临床表现具有异质性，且越来越多的证据表明，HNSCC的恶性进展需要多种基因组改变。选择性剪切作为重要的转录后调控机制之一，在HNSCC发生发展中具有重要的作用。研究证实，在病理条件下转录本的差异剪接可能导致蛋白质的结构和功能变异，其中一些选择性剪接过程的异常成为肿瘤发生发展的潜在驱动因素。在HNSCC中，选择性剪切不仅参与了肿瘤细胞的增殖、分化、迁移和侵袭等生物学过程，而且与肿瘤的免疫逃逸、化疗抵抗以及预后密切相关。

一、选择性剪切的分子机制

选择性剪接需要多种因子参与，包括核不均一RNA (heterogeneous nuclear RNA，hnRNA)，剪切因子、核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)，核小RNA结合蛋白（small nuclear ribonucleoprotein，snRNP）。剪切因子与hnRNA结合形成核酸蛋白质复合物可穿梭于细胞核与胞质之间，具有转运和剪接RNA的作用。SnRNP（包括snRNP-U1、U2、U4/U6、U5）与细胞核内snRNA（分子质量为100～200nt的小RNA）紧密结合，而构成核内小核酸蛋白质复合物snRNPP（snRNP particles），能与剪接位点结合，参与RNA剪接、多聚腺苷化以及转录拷贝3′端的成熟。

目前已有超过30种剪切因子的报道，这些剪切因子主要分为两大家族SR（serine/arginine protein）和hnRNP（heterogeneous ribonucleoprotein）。

SR蛋白家族剪切因子富含丝氨酸-精氨酸残基，共12个成员。其中RNA结合结构域（RNA binding domain）位于氨基末端（N末端），具有结合RNA的能力。羧基末端含不同丝氨酸和精氨酸残基数量的RS结构域，它能够与具有RS结构域的U2AF（U2 auxiliary factor）的35 kD亚基和U1snRNP70的蛋白质相互作用，因而能够促进U2AF和U1snRNP与剪接位点结合。因此，SR蛋白在高等真核生物中又能介导U1snRNP同5′剪接位点结合及U2AF同3′剪接位点结合。SR蛋白主要通过与不同的顺式调节因子作用起正向调控剪切的作用。如通过与外显子的剪接增强子（exonic splicing enhancer，ESE）、内含子的剪接增强子（intronic splicing enhancer，ISE）、来增强对其附近3′或5′剪接位点的识别，进而促进剪切。SR蛋白家族成员包括SC35（splicesome component of 35 kD）、SF2/ASF（splicing factor 2/alternative splicing factor，又称为SRSF1）、SRp20、SRp30、SRp40、SRp55和SRp70等。

hnRNPs蛋白家族大约包括37种亚型，是一类具有结合多聚嘧啶区域的蛋白，分子量为58kD。hnRNPs能与U2AF竞争结合多聚嘧啶区域，对3′和5′剪切位点负向调控作用，并且可以通过包裹外显子使其不被剪接体结合而使外显子被跳过。hnRNPs主要通过与外显子的剪接沉默子(exonic splicing silencer，ESS)和内含子的剪接沉默子（intronic splicing silencer，ISS）的结合，来减弱对其附近3′或5′剪接位点的识别而阻止剪切的发生。总的来说，hnRNP蛋白属于反式作用因子，hnRNPs 通常通过结合于沉默子，并且阻断了前体mRNA和剪切体的相互作用，或者抵消了SR蛋白的促进作用。作用元件的突变可改变剪接位点或改变剪接调控序列。突变能够干扰剪接位点或创造新的剪接位点，或改变其他的共同序列或影响剪接沉默子和剪接增强子。

二、选择性剪切与HNSCC细胞生物学

在HNSCC中，选择性剪切可以改变细胞周期相关蛋白的表达模式，促进肿瘤细胞的无限制增殖。例如，促进细胞周期进程的剪接异构体可以通过延长细胞周期的G1期，促进细胞进入S期，从而加速DNA合成和细胞分裂。肿瘤细胞的分化状态与肿瘤的恶性程度密切相关。选择性剪切可以影响细胞分化过程中关键转录因子的表达，导致肿瘤细胞分化受阻，形成去分化的表型。肿瘤的侵袭和转移是HNSCC治疗失败的主要原因。选择性剪切可以产生具有增强侵袭性的蛋白质异构体，这些异构体通过促进基质金属蛋白酶（MMP）的表达、改变细胞黏附分子的功能以及激活EMT相关信号通路，增强肿瘤细胞的侵袭和转移能力。

近年来研究发现EMT过程中存在基因选择性异构体的表达，包括FGFR、p120catenin、ENAH和CD44。这些基因参与了我们已知EMT过程中所发生的几种不同类型的剪切。例如，ESRPs（Epithelial Splicing Regulatory Protein）是FGFR2两种异构体分子（Ⅲb和Ⅲc）转换的开关分子，这两种异构体具有组织特异性，Ⅲb异构体主要在上皮细胞表达，而Ⅲc异构体则主要在间质细胞表达，ESRPs可通过选择性剪接作用促进Ⅲc异构体向Ⅲb转化从而抑制EMT进程。癌性剪接因子SRSF1(也称作ASF/SF2，SR蛋白家族成员)和ESRP1可通选择性剪接参与Rac1b（Rac1选择性剪接异构体）表达的调节，SRSF1上调Rac1b表达，促进EMT发生，相反，ESRP1下调Rac1b的表达，抑制EMT发生。CD44的两种异构体（CD44S和CD44V）的转换与EMT的发生密切相关，ESRP能促进CD44S向CD44V转换。

三、选择性剪切与HNSCC肿瘤微环境

肿瘤微环境在HNSCC的发展中起着至关重要的作用。选择性剪切可以通过产生影响肿瘤微环境中免疫细胞、血管内皮细胞和成纤维细胞的不同异构体，从而促进肿瘤血管生成、免疫逃逸和基质重塑等。

2019年发表于Theranostics的全基因组分析研究表明，HNSCC 患者可以根据其选择性剪切模式分为不同的亚组，这些亚组表现出生存状态、EGFR 突变/扩增、TP53 突变和免疫特征的分布不均匀。提示剪切事件可能有助于对高危患者进行分层并预测治疗反应。

同样2022年发表于Frontiers in genetics的研究利用TCGA数据库筛选了发生于HNSCC中的剪切事件，通过建立HNSCC 的预后特征模型将患者为高风险或低风险，可提示不同预后。且该研究发现具有不同模式的剪切亚组与不同的免疫状态、不同的免疫细胞群和免疫激活相关。同时研究结果表明，预测的低风险组具有更高水平的免疫细胞浸润（例如，CD8+ T细胞、Treg、记忆CD4 +T细胞、幼稚B细胞和M1巨噬细胞）和免疫激活特征（例如，细胞溶解活性、CD8+/Treg比率和IFN-γ信号传导）。相反，大多数免疫细胞和活化特征在高危患者中表达较低。

四、选择性剪切与HNSCC治疗抵抗

HNSCC的治疗抵抗是临床中的一个重大挑战。选择性剪切可通过多种机制参与肿瘤细胞对化疗、放疗和靶向治疗的抵抗性，包括改变药物代谢、DNA损伤修复能力的增强和细胞凋亡途径的抑制。例如有报道发现，MAMB在HNSCC中促进了MCL1凋亡调节因子从抗凋亡MCL1L向促凋亡MCL1S的剪接开关，进而改变HNSCC凋亡途径。肿瘤细胞可以通过选择性剪接产生的特定蛋白质影响肿瘤微环境中的免疫细胞，如T细胞、DC细胞和NK细胞，从而帮助肿瘤细胞逃避免疫监视。

五、选择性剪切与HNSCC生物标志物

特定的选择性剪接事件可以作为HNSCC诊断、预后评估和治疗反应监测的生物标志物。例如，剪切事件产生的剪接异构体的表达水平可能与肿瘤的分期、分级和患者的总体生存率相关。有研究发现在HNSCC患者中，CD44剪切后产生CD44v2，CD44v2低表达者细胞分化较差，且具有不良预后。

目前针对选择性剪接事件的治疗策略为研究热点，如使用小分子药物、反义寡核苷酸或RNA干扰技术，可能为HNSCC患者提供新的治疗选择。针对剪接体的小分子抑制剂，如SF3B1抑制剂，已发现对包括耐药细胞在内的多种肿瘤模型显示出细胞毒性，目前已有SF3B1抑制剂进入临床试验阶段。SF3B1作为骨髓异常增生综合征（MDS）中最常见的突变，其抑制剂靶向药（如H3B-8800和E-7107）已被研究用于血液肿瘤的治疗。

六、研究挑战与未来方向

尽管选择性剪切在HNSCC中的作用日益受到关注，但目前对其调控机制的理解仍然有限。未来的研究需要深入探讨剪接事件如何受到上游信号通路的调控，以及它们如何与肿瘤的其他分子机制相互作用。此外，开发新的技术和方法来检测和分析选择性剪切事件，将有助于揭示其在HNSCC中的作用。随着精准医疗的发展，针对选择性剪切的个体化治疗策略有望成为HNSCC治疗的新前沿。